Técnica
1- Confeccionar o esfregaço e fixá-lo com calor;
2- Cobrir com violeta de cristal por 60 segundos;
3- Lavar com água destilada;
4- Cobrir com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos;
5- Lavar com água destilada;
6- Descorar com álcool-acetona, 10-20 segundos;
7- Lavar com esguicho de água destilada;
8- Corar com fucsina por 60 segundos
9- Lavar com água destilada, secar e observar ao microscópio.
Obs. Vale ressaltar que todas as técnicas de coloração possuem modificações principalmente quanto ao tempo dos corantes. Cabe ao laboratorista testar qual se aplicar melhor a sua rotina.
História
Esta técnica foi inicialmente descoberta pelo médico dinamarquês Hans Chistian Joachim Gram (1853 - 1958) em 1884 buscando melhorias na visualização microscópica de amostras infectadas. Como muitos outros, Gram faleceu sem que recebesse os devidos créditos pelas suas descobertas.
Coloração
Toda a coloração é baseada na espessura da parede celular bacteriana. As bactérias denominadas "Gram +" possuem parede espessa e homogênea, geralmente não estratificada e constituída principalmente por peptideoglicano enquanto as "Gram -" também possuem peptideoglicano na constituição de sua camada porém, essa é mais fina em relação as Gram +.
Espessura da camada de peptideoglicano das bactérias Gram + |
Espessura da camada de peptideoglicano das bactérias Gram - |
Após a fixação do esfregaço, o cristal violeta é adicionado corando todas as bactérias (Gram + ou -) sem diferencia-las. A adição do lugol permite a fixação do cristal violeta no citoplasma devido a formação de complexos insolúveis.
Ao adicionar o solvente alcool-acetona a camada lipídica das bactérias Gram - é destruída permitindo que na lavagem o complexo cristal violeta-lugol seja retirado, perdendo a coloração primária.
Por último temos a utilização de fucsina, responsável pela coloração avermelhada do citoplasma das Gram -.
Resultado:
Gram +: bactérias de cor violeta
Staphylococcus aureus |
Streptococcus pyogenes |
Gram -: bactérias avermelhadas
Pseudomonas aerugionosa |
Escherichia coli |
CUIDADO
- se prolongar a exposição do solvente, o complexo formado pelo cristal violeta + lugol pode ser retirado de todas as bactérias e não somente das Gram -.
- a não utilização do solvente fará com que todas permaneçam coradas de violeta levando a uma falsa interpretação.
Fonte:
Wikipedia.com
Prof2000.pt
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